ti质粒的结构及功能区域 ti质粒的特点( 四 )

目前以T-DNA转化植物细胞的标准 *** 大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。由于双元载体系统的T-DNA和Vir 区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体(trans-vector) 。
（6）Ti 质粒介导的转移转化 ***
目前已建立了多种根癌农杆菌Ti 质粒介导的植物基因转化 ***，其基本程序包括：含重组Ti 质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。
叶盘转化法：
叶盘转化法(leaf dish transformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化 ***。其操作步骤为：首先用打孔器从消毒叶片上取下直径为2～5mm 圆形叶片，即叶盘。再将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。
然后用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将这种经浸染处理过的叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。
叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的 *** 进行转化。该 *** 的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最多的 *** 之一。
原生质体共培养转化法：
原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。
整株感染法：
此法是模仿根癌农杆菌天然的感染过程，用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的 ***。其做法是：人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率，一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗。用去除了致瘤基因的根癌农杆菌进行整株感染后，受伤部位一般不会出现肿瘤。在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化
的新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌
浸泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌芽种子的 ***，也可以得到转基因植株及种
子。
2 发根农杆菌介导转化法
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌。但与根癌农杆菌不同的是，发根农杆菌从植物伤口入侵后，不能诱发植物产生冠瘿瘤，而是诱发植物产生许多不定根。这些不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根或发状根(hairy root) 。发状根的形成是由存在于发根农杆菌中的Ri质粒(root inducing pla *** id,根诱导质粒)所决定的。